分子診斷：應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。分子診斷是預(yù)測(cè)診斷的主要方法，既可以進(jìn)行個(gè)體遺傳病的診斷，也可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)

概述
分子診斷主要是指編碼與疾病相關(guān)的各種結(jié)構(gòu)蛋白、酶、抗原抗體、免疫活性分子基因的檢測(cè)。

標(biāo)本采集
合理的標(biāo)本采集對(duì)保證標(biāo)本的完整性和核酸的定性/定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的。標(biāo)本應(yīng)嚴(yán)格按照適當(dāng)?shù)纳锇踩改线M(jìn)行采集，不合適的標(biāo)本處理會(huì)導(dǎo)致核酸降解，產(chǎn)生錯(cuò)誤的患者檢測(cè)結(jié)果。
1. 標(biāo)本識(shí)別 標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)明確患者身份及其標(biāo)本，充分尊重患者隱私。同時(shí)應(yīng)為醫(yī)療人員提供合理而充足的檢測(cè)和治療相關(guān)的信息。標(biāo)本應(yīng)牢固地貼上標(biāo)簽，內(nèi)容至少包括：識(shí)別號(hào)、采集日期和時(shí)間、標(biāo)本采集者姓名、標(biāo)本來(lái)源等。
2. 申請(qǐng)單信息 申請(qǐng)單至少包括以下幾點(diǎn)信息：唯一標(biāo)識(shí)號(hào)、入院登記號(hào)、患者姓名、出生日期、性別、種族、采集日期、標(biāo)本類型、相關(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)室信息、醫(yī)生姓名、標(biāo)本采集的部門、檢測(cè)申請(qǐng)?jiān)虻取?/span>
3. 標(biāo)本采集 采集人體組織或體液標(biāo)本時(shí)應(yīng)遵守相關(guān)的安全防范措施，佩戴手套，預(yù)防標(biāo)本中血源性病原體的傳播，同時(shí)阻止標(biāo)本被處理人員的脫落細(xì)胞污染。特定的檢測(cè)方法可能需要額外的預(yù)防措施和采集說(shuō)明，如HPV檢測(cè)采集宮頸標(biāo)本應(yīng)在醋酸試驗(yàn)之前。實(shí)驗(yàn)室采用不同的檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)考慮潛在的干擾和污染來(lái)源，正確指導(dǎo)和培訓(xùn)臨床醫(yī)生按照特定方法或檢測(cè)體系的標(biāo)本采集要求進(jìn)行采集。臨床實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后應(yīng)盡快將標(biāo)本信息輸入至實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（LIS），同時(shí)應(yīng)盡快處理接收的標(biāo)本。如果標(biāo)本存在如溶血、冰凍血液或標(biāo)記不當(dāng)?shù)惹闆r應(yīng)考慮拒收。
4. 抗凝劑 血液和骨髓穿刺（BMA）標(biāo)本采集應(yīng)使用合適的抗凝管或含其他添加劑的試管。試管添加劑的選擇應(yīng)根據(jù)分析物類型、試驗(yàn)、標(biāo)本量而定，有研究表明肝素和亞鐵血紅素可能會(huì)抑制PCR反應(yīng)。因此，推薦使用EDTA和ACD抗凝劑檢測(cè)血漿或骨髓穿刺標(biāo)本。如果被測(cè)量為細(xì)胞內(nèi)RNA，采集血液或骨髓的設(shè)備應(yīng)包含RNA穩(wěn)定劑，或者在采集后立即加入RNA穩(wěn)定溶液。
5. 組織標(biāo)本 如果無(wú)法獲得血液或口腔黏膜細(xì)胞（如患者死亡），或者組織標(biāo)本的基因型同血液或口腔黏膜細(xì)胞不同，或者組織為某些潛在感染物質(zhì)核酸的唯一來(lái)源時(shí)，可采用組織標(biāo)本。通常最佳的組織量為1-2g，但由于各種組織所含的DNA和RNA的量不同，采集組織的量也因組織而異。多細(xì)胞組織如骨髓、淋巴結(jié)、脾適用于基因組DNA檢測(cè)，需要的組織量較少。少細(xì)胞標(biāo)本如肌肉、纖維、脂肪組織不是基因組DNA的最佳來(lái)源，采集量最好大于1-2g。通常，如果沒(méi)有廣泛脂肪浸潤(rùn)，大于10mg的組織至少獲得10μg的RNA或DNA。不同組織的蛋白質(zhì)的量和類型各不相同，核酸分離方法也因組織而異。按照特定來(lái)源的組織，根據(jù)廠家建議分離DNA或RNA。
病理科醫(yī)生通常從大塊組織中采取有代表性的部分組織進(jìn)行固定、染色、顯微鏡檢測(cè)和病理診斷，或者選擇有代表性的組織提取DNA或RNA進(jìn)行分子學(xué)分析。一般選擇病灶組織進(jìn)行檢測(cè)、非病灶組織作為對(duì)照。對(duì)照組織對(duì)某些分子檢測(cè)是至關(guān)重要的，如雜合性缺失分析或微衛(wèi)星不穩(wěn)定性試驗(yàn)。
技術(shù)種類
分子診斷是當(dāng)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要前沿領(lǐng)域之一，其核心技術(shù)是基因診斷，常規(guī)技術(shù)包括：
（1）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）；
（2）DNA測(cè)序（DNA sequencing）；
（3）熒光原位雜交技術(shù)（FISH）；
（4）DNA印跡技術(shù)（ DNA blotting ）；
（5）單核苷酸多態(tài)性（SNP）；
（6）連接酶鏈反應(yīng)（LCR）；
（7）基因芯片技術(shù)（gene chip）。

應(yīng)用領(lǐng)域
其中，PCR產(chǎn)品占據(jù)目前分子診斷的主要市場(chǎng)，基因芯片是分子診斷市場(chǎng)發(fā)展的主要趨勢(shì)。PCR產(chǎn)品靈敏度高、特異性強(qiáng)、診斷窗口期短，可進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，可廣泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、優(yōu)生優(yōu)育、遺傳病基因、腫瘤等，填補(bǔ)了早期免疫檢測(cè)窗口期的檢測(cè)空白，為早期診斷、早期治療、安全用血提供了有效的幫助?；蛐酒欠肿由飳W(xué)、微電子、計(jì)算機(jī)等多學(xué)科結(jié)合的結(jié)晶，綜合了多種現(xiàn)代高精尖技術(shù)，被專家譽(yù)為診斷行業(yè)的終極產(chǎn)品。但其成本高、開(kāi)發(fā)難度大，目前產(chǎn)品種類很少，只用于科研和藥物篩選等用途。[1] 

基本原理
分子診斷的主要技術(shù)有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)和生物芯片技術(shù)。
1.核酸分子雜交技術(shù) 具有一定互補(bǔ)序列和核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則締合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列和探針序列。應(yīng)用該技術(shù)可對(duì)特定DNA或RNA序列進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。
2.聚合酶鏈反應(yīng)（即Polymerase chain reaction，PCR）[2]  原理：PCR是模板DNA，引物和四種脫氧核糖核昔三磷酸（dNTP）在DNA聚合酶作用下發(fā)生酶促聚合反應(yīng)，擴(kuò)增出所需目的DNA。包括三個(gè)基本步驟：雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈（變性）；在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)（退火）；在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸。
3.生物芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)與微電子技術(shù)相結(jié)合的核酸分析檢測(cè)技術(shù)。最初的生物芯片技術(shù)主要目標(biāo)是用于DNA序列測(cè)定、基因表達(dá)譜鑒定和基因突變體檢測(cè)和分析，所以又稱為DNA芯片或基因芯片技術(shù)。由于目前這一技術(shù)已擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)芯片、免疫芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等，所以改稱生物芯片技術(shù)更符合發(fā)展趨勢(shì)。

基本流程
多年來(lái)，大部分分子診斷實(shí)驗(yàn)室的核心技術(shù)都主要集中在檢測(cè)特異性、相對(duì)較短的DNA或RNA片段上。該技術(shù)能診斷傳染性疾病、鑒別影響藥物代謝的特殊基因變異型或檢測(cè)與疾病有關(guān)的基因，如與癌癥有關(guān)的基因。這些檢測(cè)的核心是實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)擴(kuò)增（TMA）、靶向擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增等類似技術(shù)的應(yīng)用。桑格排序和DNA片段分析或采用毛細(xì)電泳法的凝膠法都是分子診斷實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵技術(shù)，但他們通常還包括檢測(cè)過(guò)程中的擴(kuò)增步驟。為了能順利應(yīng)用那些采用DNA和RNA來(lái)診斷疾病的檢測(cè)，分子診斷實(shí)驗(yàn)室必須要使用定義明確的工作流程，從而得到穩(wěn)定的、有效的結(jié)果，而當(dāng)前已存在能幫助診斷實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)每個(gè)工作流程流水化的特殊工具。檢測(cè)的基本流程如下所示：
1、樣本收集和制備。 從樣本中提取出用于檢測(cè)的基因。
2、擴(kuò)增：一旦分離出基因物質(zhì)，必須立即將其擴(kuò)增到可檢測(cè)數(shù)量，以便做出診斷命令。
3、檢測(cè)：獲得足夠的目標(biāo)物質(zhì)后，光型傳感器將讀取與即將檢測(cè)的目標(biāo)物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的信號(hào)。信號(hào)必須是單一的或多樣的，從而實(shí)現(xiàn)在一次反應(yīng)（如多通道檢測(cè)）中檢測(cè)到多種目標(biāo)物質(zhì)。
4、數(shù)據(jù)分析：對(duì)在檢測(cè)步驟中讀取出的信號(hào)進(jìn)行分析。將分析結(jié)果轉(zhuǎn)換為實(shí)驗(yàn)室人員隨時(shí)可以解釋的信息，從而最終為臨床醫(yī)生提供診斷結(jié)果。

發(fā)展趨勢(shì)
世界各國(guó)高度重視分子診斷技術(shù)的發(fā)展，基因芯片將成為新一代分子診斷試劑開(kāi)發(fā)的主流?；蛐酒欠肿由飳W(xué)、微電子、計(jì)算機(jī)等多學(xué)科結(jié)合的結(jié)晶，綜合了多種現(xiàn)代高精尖技術(shù)，被專家譽(yù)為“診斷行業(yè)的終極產(chǎn)品”?；蛐酒哂型瑫r(shí)能夠檢測(cè)多個(gè)靶點(diǎn)的功能，具有快速有效的特點(diǎn)。因而基因芯片成為新一代分子診斷試劑的主要開(kāi)發(fā)方向，但其成本高、開(kāi)發(fā)難度大，目前產(chǎn)品種類很少，只用于科研和藥物篩選等用途。目前基因芯片的大規(guī)模臨床應(yīng)用還存在尚未克服的技術(shù)缺陷，主要是由于芯片診斷特異性和靈敏度低、芯片診斷成本高昂和芯片診斷配套儀器價(jià)格昂貴等原因。目前全球，雖然只有少數(shù)的芯片可用于臨床診斷，但國(guó)內(nèi)基因芯片技術(shù)已經(jīng)處于世界領(lǐng)跑的地位?；蛐酒夹g(shù)將是熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)最具挑戰(zhàn)的潛在對(duì)手，主要是：熒光定量PCR 技術(shù)一次只能檢測(cè)一個(gè)或幾個(gè)目標(biāo)基因，而基因芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量目標(biāo)基因的同時(shí)檢測(cè)。隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展，基因芯片在國(guó)內(nèi)外已成為研發(fā)熱點(diǎn)。若基因芯片技術(shù)迅速成熟并大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，將對(duì)熒光定量PCR 檢測(cè)產(chǎn)生較大的沖擊。不過(guò)，目前基因芯片的大規(guī)模臨床應(yīng)用還存在尚未克服的技術(shù)缺陷，主要是由于芯片診斷特異性和靈敏度低、芯片診斷成本高昂和芯片診斷配套儀器價(jià)格昂貴等原因，預(yù)計(jì)熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)在今后5 到10 年內(nèi)可保持領(lǐng)先。